肝癌细胞靶向肽的筛选与鉴定

利用噬菌体环七肽库筛选与肝癌细胞特异性结合的多肽,并对其亲和力进行生物学鉴定。以HL-7702为消减细胞,HepG2为筛选靶细胞,对噬菌体随机环七肽库进行4轮全细胞消减筛选,并随机挑取60个阳性噬菌体克隆,以ELISA法鉴定其与HepG2细胞的结合活性,并取阳性克隆进行测序分析,并合成多肽进行免疫细胞化学染色鉴定。经4轮筛选,噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集;利用ELISA从随机挑选的60个噬菌体克隆中得到15个与肝癌细胞具有高结合力的阳性克隆,测序并进行序列分析比对发现氨基酸序列无同源性,经免疫细胞化学染色鉴定后,发现1条多肽序列亲和力较高,为提高抗菌肽对肿瘤细胞的靶向杀伤作用奠定基础。     

1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为⁸⁴M～K¹⁴²;噬菌体淘选试验结果表明,¹¹⁶TSSFETLFE¹²⁴为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。     

抗C反应蛋白单域抗体噬菌体库的构建与初步鉴定

以CRP为免疫原免疫双峰驼后分离外周血淋巴细胞,提取总RNA后经逆转录制备cDNA,通过巢式PCR实验获得目的基因片段并克隆至噬菌体T7载体臂上,构建原始噬菌体库。随后进行4轮生物淘选,通过Phage-ELISA鉴定淘选后的噬菌体库,BamHⅠ、HindⅢ双酶切构建了pET-28a与阳性克隆的重组质粒,转化入BL21菌株中进行低温诱导表达。经过His-镍离子亲和层析柱纯化获得单域抗体,然后再用间接ELISA鉴定单域抗体与CRP的反应性。研究结果显示,试验成功构建了库容为1.08×10~8 cfu的抗CRP单域抗体噬菌体库,基因插入率为96.43%(27/28)。生物淘选获得了4株与CRP特异性结合的阳性克隆,4株阳性克隆表达载体构建成功,并在BL21细胞中成功表达单域抗体,分子质量约为22 ku。经ELISA鉴定,4个抗体均显示出高亲和力与特异性,其中V2与V3的抗体效价高达1∶3 200,证明该抗体能够适用于实际检测方法开发。